JURNAL - KCKT
"Analisa Kafein Dengan Alat HPLC"
ABSTRAK
Penentuan kadar kafein dalam sampel
kafein. Sampel di larutkan dengan
pelarut aquabidest, kemudian sampel di saring dengan pompa vakum dengan
menggunakan kertas saring khusus ( kertas saring 47 mm, 0,45 µm ), hasil
saringan dianalisa dengan alat HPLC ( High Performance Liquid Chromatography )
dimana fasa geraknya adalah methanol : aquabidest ( 30 mL : 70 mL ),
menggunakan detektor S2500 UV dengan panjang gelombang 272 nm, menggunakan
kolom kromasil 100-5C 18, dengan sistem pengaliran fasa
geraknya adalah isokratik. Hasil percobaan menunjukkan konsentrasi larutan
contoh yaitu 5,088 ppm yang di injeksi sebanyak 15 µL dan memperoleh
waktu retensi selama 1,000 menit dengan AREA = 45003, AREA % = 24,33, HEIGHT =
8248, HEIGHT % = 72,45.
Determination of caffeine content in
a sample of caffeine. Samples dissolved in a solvent
aquabidest, then samples were filtered with a vacuum pump by using a special
filter paper (filter paper 47 mm, 0.45 μm), the filter was analyzed by
instrument of HPLC (High Performance Liquid Chromatography) in which the
movement phase is methanol : aquabidest (30 mL: 70 mL), using the S2500 UV
detector with a wavelength of 272 nm, using a column kromasil 100-5C18,
the drainage system is an isocratic phase motion. The experimental results
showed the concentration of sample solution is 5,088 ppm of the injection of 15
µL and obtained during the retention time1,000 minutes with AREA = 45003,
AREA% = 24,33, HEIGHT = 8248, HEIGHT = 72,45%.
BAB I
PENDAHULUAN
A .Latar Belakang
HPLC (High Performance Liquid Ch0-an oromatoggraphy) atau
biasa juga disebut dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan
pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an, saat ini HPLC merupakan teknik
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat ,baik dalam bulk
atau dalam sediaan farmasetik.
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas : wadah fase
gerak,pompa,alat untuk memasukkan sampel(tempat injeksi) kolom,detector,wadah
penampungbuangan fase gerak,dan suatu computer atau integrator atau perekam.
(http://en.wikipedia.org/wiki/ kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT)
Kafeina atau populernya kafein ialah senyawa alkaloid xantina
berbentuk Kristal dan berasa pahit yang bekerja sebagai obat perasangsang
psikoaktif dan diuretic ringan.kafeina ditemukan oleh seorang kimiawan jerman
friedrich Ferdinand runge pada tahun 1819.Ia menciptakan istilah “kaffein”
untuk merujuk pada senyawa kimia pada kopi.
B.Rumusan Masalah
·
Peralatan yang digunakan untuk
analisa contoh dalam bentuk bulk atau sediaan farmasetik
·
Prinsip kerja dari HPLC
·
Sumber dari kafein
C. Tujuan
1..Untuk mengetahui cara menggunakan HPLC
2. Untuk dapat menentukan retention time,area,kadar area, height
dan kadar dari kafein.
BAB II
PEMBAHASAN
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure
Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia.
KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan
fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini
jika dibandingkan dengan metode lainnya (Done dkk, 1974; Snyder dan Kirkland,
1979; Hamilton dan Sewell, 1982; Johnson dan Stevenson, 1978). Kelebihan itu
antara lain:
• Mampu memisahkan
molekul-molekul dari suatu campuran
• Mudah
melaksanakannya
• Kecepatan analisis
dan kepekaan yang tinggi
• Dapat dihindari
terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
• Resolusi yang baik
• Rapat digunakan
bermacam-macam detektor
• Kolom dapat
digunakan kembali
• Mudah melakukan
"sample recovery"
Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kuantitatif dan
sekaliguskualitatif. Untuk analisa kualitatif dengan membandingkan kromatogram
sampel dengan kromatogram
baku pembanding berdasarkan waktu retensinya.
Sedangkan untuk analisa kuatitatif dapat digunakan dengan
persamaan :
Cx = Ax / Ap X Cp
Keterangan :
A = Peak area = Luas puncak
C= Konsentrasi
X = sampel
P = pembanding
Atau jika ingin mendapatkan data yang lebih valid dapat pula
ditentukan dengan menggunakan kurva kalibrasi larutan standar.
1.
JENIS HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan
dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase
geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding
dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering
kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase
terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC
juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan
pada mekanisme sorpsi solut; dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam
kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi
adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika
gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika
sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan
berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang
berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan
puncak yang berekor3).
2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang
dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk
memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan
oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer
digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan
pemisahannyaadalahfaseterbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat
3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase
diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak
penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang
palingluaspenggunaannyaadalahpolistirenresin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.
4.Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan
sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode
penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yangmempunyai muatan yang berlawanan.
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel
dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat
molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang
bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel),
atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih
besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran
medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan
solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara
partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini
tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe
kromatografi yang lain.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi
biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang
hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan
dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalaminteraksiantara antigen dan antibodi). Kromatografi
jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang
sangat kompleks).
2.
SISTEM PERALATAN HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya
terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat
injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu
komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair
seperti ini :
1.
Wadah Fase gerak dan Fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut
kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak.
Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter
pelarut(1).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut
yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan
resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan
pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase
normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat
dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam
kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan
meningkatnyapolaritaspelarut.
Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu
untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam
fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen
lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase
gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak
berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada
kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi
campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran
polaritasyangluas4).
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan
fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air
dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling
sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut
yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan
dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert
terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja
tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit
3. Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke
dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat
penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang
dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal. Posisi
pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel
4. Kolom dan Fase diam
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan
kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam
untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3
keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:
·
Konsumsi fase gerak kolom mikrobor
hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada
kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
·
Adanya aliran fase gerak yang lebih
lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer
massa.
·
Sensitivitas kolom mikrobor
ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat
bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak
setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan
divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya
residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan
menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi
dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling
banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi
lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil
(nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika
yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi
disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.
5.Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu:
oluter universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik,
dan tidak bersifat selektif) seperti oluter indeks bias dan oluter spektrometri
massa; dan golongan oluter yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit
secara spesifik dan selektif, seperti oluter UV-Vis, oluter fluoresensi, dan
elektrokimia.
Idealnya, suatu oluter harus mempunyai karakteristik sebagai
berikut: (1) mempunyai respon terhadap olute yang cepat dan reprodusibel; (2)
mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi olute pada kadar
yang sangat kecil; (3) stabil dalam pengopersiannya; (4) mempunyai sel volume
yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita; (5) signal yang
dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi olute pada kisaran yang luas
(kisaran dinamis linier); dan (6) tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan
alir fase gerak2).
2.
ELUSI GRADIEN
Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa
gerak selama analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah
mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom.
Dasar-dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder.
Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :
a. Total waktu analisis dapat direduksi
b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran
bertambah
c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)
d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak
Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi
Gradien dapat dipilih dengan cara trial and error.
1.
DATA HANDLING
Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam
bentuk kromatogram pada rekorder. waktu retensi dan volume
retensi dapat diketahui /dihitung. Lni bisa digunakan untuk mengidentifikasi
secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi kerja dapat dikontrol. Lebar
puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan konsentrasi dan
dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif.
2.
FASA GERAK
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak
adalah salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi
yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa
sifat umum yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable
price)
Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang
karena prosedur pemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal biayanya. Dari
semua persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.
Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk
KCKT yang menggunakan pompa bolak balik (reciprocating pump) sangat diperlukan
terutama bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut
yang tidak dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor
sehingga data yang diperoleh tidak dapat digunakan (the data may be useless).
Menghilangkan gas (degassing) juga sangat baik bila menggunakan kolom yang
sangat sensitifterhadap udara (contoh : kolom berikatan dengan NH2). (Rucker,
G 1988)
BAB III
METODE ANALISA
Alat dan Bahan
ALAT :
1. Gelas Piala 50 ml
2. Labu ukur 100 ml dan 50 ml.
3. Corong
4. Pengaduk
5. Mikroburet
6. Kertas Saring
7. Neraca Digital
8. HPLC
9. Pompa vakum
BAHAN :
1. Kafein
2. Aquabidestilata steril
CARA KERJA
A.
Preparasi Sampel
- Ditimbang 0,0212 gram
kafein
Tabel pengamatan :
Bobot sampel (kafein) = 0,0212 gram
Perhitungan :
·
Bobot kafein yang ditimbang untuk
larutan induk 200 ppm
ppm =
200ppm =
= 20 mg = 0,02 g
·
Konsentrasi larutan stok sebenarnya
ppm =
=
= 212 ppm
·
Pengenceran untuk 5 ppm
V1C1 = V2C2
V1 . 212 ppm = 50 ml . 5ppm
V1
·
Konsentrasi larutan standar kafein
sebenarnya
V1C1 = V2C2
1,20 ml. 212 ppm
= 50 ml . C2
5,088 ppm = C2
BAB V
KESIMPULAN DAN
SARAN
Kesimpulan
Dari hasil analisa kafein 5 ppm dengan alat HPLC dapat
disimpulkan bahwa :
Retention time : 1,000 menit
Area : 45003
Area% : 24,33 %
Height : 8248
Height % : 72,45 %
Saran
Bagi peserta praktikum, untuk mendapatkn data yang akurat
dan hasil analisis yang memuaskan,ada beberapa hal yang perlu diperhatikan :
·
Penguasaan teori dasar
·
Prosedur kerja
·
Penguasaan alat yang tepat
0 komentar:
Posting Komentar