PENETAPAN KADAR KAFEIN DALAM MINUMAN
DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI ( HPLC )
TUJUAN PERCOBAAN
1. Mahasiswa mengetahui prinsip dasar analisa sampel dengan alat HPLC
2. Mahasiswa mampu menentukan kadar kafein dalam suatu sampel
TEORI SINGKAT
Kromatografi merupakan salah satu tekhnik pemisahan yang dapat
memisahkan setiap komponen dalam suatu campuran. Pemisahan ini didasarkan
pada perbedaan migrasi setiap komponen yang disebabkan karena perbedan sifat
interaksi dari setiap komponen pada fase diam dan fase gerak. Berdasarkan fase
geraknya metode kromatografi terbagi menjadi kromatografi cair dan
kromatografi gas. Salah satu contoh dari pengembangan kromatografi cair adalah
HPLC ( High Perfomance Liquid Chromatograpy ) atau kromatgrafi cair kinerja
tinggi.
HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan
memakai fase diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang
distribusi ukuranya sempit ( kolom ) dan fase gerak yang dipaksa mengalir dengan
laju alir yang terkendali dengan memakai tekanan tinggi sehingga menghasilkan
pemisahan dengan resolusi tinggi dan waktu yang relative singkat.
Resolusi adalah pengukuran secara fisik suatu pemisahan. Resolusi dapat
dirtngkatkan dengan mengooptimasi parameter-parameter HPLC yaitu retensi,
selektivitas, dan efisiensi. Secara praktis parameter-parameter tersebut dapat
dioptimalkan dengan mengubah :
1. komposisi dari fase gerak
2. laju alir
3. sifat kimia dari fase gerak
4. jenis kolom
Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kuantitatif dan sekaligus
kualitatif. Untuk analisa kualitatif dengan membandingkan kromatogram sampel
dengan kromatogram baku pembanding berdasarkan waktu retensinya.
Sedangkan untuk analisa kuatitatif dapat digunakan dengan persamaan :
Cx = Ax / Ap X Cp
Keterangan :
A = Peak area = Luas puncak
C = Konsentrasi
X = sampel
P = pembanding
Atau jika ingin mendapatkan data yang lebih valid dapat pula ditentukan
dengan menggunakan kurva kalibrasi larutan standar.
ALAT DAN BAHAN
Alat
1. HPLC Series 200 dengan detector 275 nm Perkin Elmer
2. Kolom : Supelcosil LC : 18, ( 25 cm X 4,6mm, 5 μm )
3. Pipet volum 10 mL
4. Tabung ekstraksi
5. Kertas saring
6. Corong
7. Baker glass 50 mL
8. Gelas ukur 50 mL
Bahan
1. Minuman Berkafein ( dalam percobaan ini sampel yang digunakan adalah
Teh Poci Tubruk )
2. Dichlorometane 50 mL
3. Asam Asetat 70 % ( sebagai fase gerak )
4. Methanol 30% ( sebagai fase gerak )
5. Larutan kafein baku / standar 200 ppm
PROSEDUR KERJA
A. Tahap Preparasi
1. Ambil sampel sebnayak 50 mL kemudian diekstraksi dengan larutan
dichlorometane sebanyak 50 mL dengan menggunakan tabung ekstraksi.
2. Diamkan kira-kira selama 15 menit ( proses aerasi ), sambil mengamati
reaksi yang terjadi, maka dengan sendirinya akan tampak pemisahan
antara air dengan dikchlorometane yang mengikat kafein. Pemisahan ini
terjadi karena adanya perbedaan berat jenis antara dichlorometane (
1.3g/cm³ ) dengan air (1g/cm³ )
3. Ambil beberapa mL sampel ( ambil sampel yang berada dibawah sekat
pemisah) yang telah diekstraksi, kemudian saring dengan menggunakan
kertas saring.
4. Ambil sebanyak 1 mL sampel yang telah disaring kemudian masukan ke
dalam gelas vial.
B. Tahap Injection ke HPLC
1. Masukan sampel yang akan diuji ke dalam auto sampler. Tentukan
komposisi fase gerak yakni Asam Asetat 70 % dan Methanol 30% serta
laju alir 1,5 mL / menit.
2. Lakukan pemograman alat
3. Sampel diinjeksikan melalui injection port secara otomatis
4. Menentukan kadar kafein dalam sampel
DATA PENGAMATAN
§ Data pengamatan dapat dilihat dalam lampiran
|
|||||||||
PEMBAHASAN
ANALISIS KUANTITATIF
Metoda Persentase Tinggi / Lebar Puncak
Metoda ini disebut juga Metoda Normalisasi Internal. Untuk analisis
kuantitatif diasumsikan bahwa lebar atau tinggi Puncak (Peak) sebanding
(proportional) dengan kadar / konsentrasi zat yang menghasil puncak. Dalam
metoda yang paling sederhana diukur lebar atau tinggi Puncak, yang kemudian
dinormalisasi (ini berarti bahwa setiap lebar atau tinggi Puncak diekspresikan
sebagai suatu persentase dari total). Hasil normalisasi dari lebar atau tinggi
puncak memberikan komposisi dari campuran yang dianalisis, seperti contoh pada
Tabel berikut:
Berdasarkan data table diatas, maka kadar kafein dalam sampel ( teh poci )
dapat dianalisis dengan mengunakan persamaan :
Cx = Ax / Ap X Cp
= 2216635,31 X 200 ppm
2601417,40
= 170,42 ppm
Maka dalam 1 mL sampel yang diuji terdapat 0,17042 mg kafein.
Ada dua masalah dengan pendekatan ini, yaitu:
Kita harus yakin bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang tiap-tiap
komponen muncul sebagai suatu puncak yang terpisah pada kromatogram.
Komponen-komponen dapat berkoelusi, atau ditahan di dalam kolom, atau
,terelusi tanpa terdeteksi. Kita harus mengasumsi bahwa kita memperoleh respons
detektor yang sama untuk setiap komponen Untuk mengatasi kesulitan ini, maka
kalibrasi detektor diperlukan.
ANALISA KOMPOSISI ASAM LEMAK DALAM MINYAK CURAH
DENGAN GCMS
TUJUAN PERCOBAAN
1. Mahasiswa mampu memahami prinsip-prinsip dasar analisa sampel dengan
GCMS.
2. Mahasiswa mampu menjelaskan kembali dan melaporkan hasil percobaan
secara ringkas, sistematis, dan akurat.
3. Mahasiswa mampu menentukan komposisi asam lemak dalam minyak curah
dengan tekhnik analisa GCMS
TEORI SINGKAT
Kromatografi gas adalah metode analisis, dimana sampel terpisahkan secara
fisik menjadi bentuk molekul-molekul yang lebih kecil ( hasil pemisahan dapat
dilihat dengan berupa kromatogram ). Sedangkan Spektroskopi masa adalah
metode analisis, dimana sampel yang dianalisis akan diubah menjadi ion-ion gas-
nya, dan masa dari ion-ion tersebut dapat dikur berdasarkan hasil deteksi berupa
Spectrum Massa.
Pada GC hanya terjadi pemisahan untuk mendapatkan komponen yang
diinginkan, sedangkan bila dilengkapi dengn MS ( berfungsi sebagi detector )
akan dapat mengidentifikasi komponen tersebut, karena bisa membaca Spektrum
bobot molekul pada suatu komponen, karena dilengkpi dengan Library ( reference
) yang ada pada software. Secara instrument, MS adalah detector GC
Sampel-sampel yang dapat dianalisis dengan menggunakan GCMS, harus
memenuhi beberapa syarat diantaranya :
§ Dapat diiuapkan pada suhu – 400 C
§ Secara termal stabil ( tidak terdekomposisi pada suhu – 400 C
§ Sampel-sampel dapat dianalisis setelah mlalui tahapan preparasi yang khusus.
Proses Pemisahan GC
Pemisahan komponen senyawa dalam GC terjadi di dalam koklom ( kapiler
) dengan melibatkan dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam adalah
zat yang ada di dalam kolom, sedangkan fase gerak adalah gas pembawa ( Helium
ataupun hydrogen dengan kemurnian tinggi, yaitu 99,.995 %.
Proses pemisahan dapat terjadi karena terdapat perbedaan kecepatan alir dari
tiap molekul di dalam kolom. Perbedaan tersebut dapat disebabkan oleh
perbedaan afinitas antar molekul dengan fase diam yang ada di dalam kolm.
Instrumentasi GCMS
Bagian-bagian dari instrument Kromatografi Gas adalah sebagia berikut :
§ Pengatur aliran gas ( Gas Flow Controller )
§ Tempat injeksi sampel ( Injector )
§ Kolom ( tempat terjadinya pemisahan )
§ Lalu dihubungkan pada interface ( fungsi interface adalah sebagai penghubung
antara GC dan MS )
Sedangkan bagian-bagian dari Spektrofotometer Massa adalah sebagai berikut :
§ Tempat masuk sampel ( malalui interface )
§ Sumber Ion ( Ion Source )
§ Pompa Vakum ( Vacum Pump )
§ Penganalisis Massa ( Mass Analyzer )
§ Detektor ( Electron Multiplier Detector )
Setelah data terdeteksi, lalu data dikirimkan ke system pengolah data ( Pada
Personal Computer ) untuk diolah dan dianalisis.
Pengaturan temperature kolom pemisahan sangat penting karena pemisahan
komponen sangat dipengaruhi oleh kenaikan temperature dan laju alir gas
pembawa. Kromatigrafi Gas Spektroskopi Massa dapat digunakan untuk analisis
kualitatif dan analisis kuantitatif dengan cara membandingkan ( standar )
berdasrkan waktu retensi.
ALAT DAN BAHAN
Alat
1. GCMS QP 2010 [ Kolom 12 Tx – MS, temperature kolom 80 C, temperature
injeksi 250 C, Carier gas He, Injection 201 ( split ) ]
2. Gelas ukur
3. Beker glass
4. Tabung reaksi beserta rak-nya
5. Pemanas
6. Pipet mikro
7. Pipet biasa
8. Vorteks
9. Centrifuge
Bahan
1. Methanol
2. NaOH 0,5 N dalam methanol
3. Sampel ( Minyak Curah )
4. N-Heksan
5. BF3 dalam methanol
PROSEDUR KERJA
A. Petunjuk Pemakaian GCMS
§ Buka karan gas He
§ Tekan tombol power GCMS
§ Nyalakan computer dan proses pemvakuman, perhatikan hinga auto
vakum selesai
§ Pada munu Real Time Analisis kik Metode file. Bila ingin memanggil
metode lama klik open lalu pilih metode yang diinginkan. Bila ingin
membuat metode baru klik new lalu isi sampel login dan tentukan
temperature program, kolom oven, suhu injeksi, split rasio, lalu OK dan
tunggu hingga kondisi temperature tercapai dan siap analisis ( redy,
berwarna hijau )
B. Preparasi Sampel ( Proses Esterifikasi )
§ Sebanyak 2 mL sampel ( minyak curah ) masukan ke dalam tabung reaksi
kemudian direaksikan ( tambahkan ) 4,5 mL NaOH 0,5 N ( dalam
methanol )
§ Vorteks ( mixer ) dan dipanaskan selama 5 menit pada suhu 70 C sampai
terbentuk 2 lapisan.
§ Kemudian didinginkan, setelah dingin tambahkan ( reaksikan ) 3 mL BF3
dalam methanol kiemudian di vorteks kembali.
§ Kemudian dipnaskan kembali selama 5 menit
§ Kemudian didinginkan, selanjutnya tambahkan ( reaksikan ) dengan 3 mL
Heksan
§ Vorteks, lalu panaskan kembali selama 5 menit.
§ Kemudaian disentrifuge ( 7000 rpm ) selama 5 mneit
§ Kemudian ambil sampel yang berada pada lapisan atas untuk diuji..
C. Analisa Komposisi Asam lemak dengan GCMS
§ Sebanyak 1 mL sampel minyak curah yang telah diesterifikasi diihjeksikan
ke dalam kolom GC dengan menggunakn metode Auto Sampler.
§ Pemisahan dilakukan dalam kolom RTx – MS Restech,
§ Hasil analisa berupa Spektrum Massa dibandingkan dengan library
WILLEEY 147 dan NIST 47 yang terdapat dalam GCMS untuk
mengetahuui komposisi asam lemak yang terdapat pada sampel
DATA PENGAMATAN
§ Data pengamatan dapat dilihat dalam lampiran.
PEMBAHASAN
Berdasarkan hasil chromatogram, diperoleh puncak-puncak dengan tinggi
tertentu, dengan adanya puncak-puncak tersebut dapat dijadikan indikasi adanya
zat penyusun ( asam lemak ) yang merupkan komposisi dari sampel.
Dari sampel yang kami uji yaitu minyak curah, secara kualitatif dalam
sampel terdapat berbgai macam asam lemak yang terkandung didalamya, yaitu
meliputi :
1. Methyl tridecanoat
2. Methyl mrystate ( C14H28O2 )
3. Methyl ( 9E )-9-dodecenoat ( C13H24O2 )
4. Methyl palmitat ( C17H34O2 )
5. Methyl margarate ( C18H36O2 )
6. Methyl linoleat ( C19H34O2 )
7. Methyl oleat ( C19H36O2 )
8. Methyl stearat ( C19H38O2 )
9. Methyl arachate ( C21H42O2 )
Dalam percobaan ini kami mengidentifikasi asam lemak yang menyusun
sampel ( minyak curah ) hanya baru pada tahap identifikasi secara kualitatif saja.
Namun untuk mendapatkan data kadar dari masing-masing asam lemak secara
kuantitatif kita harus menggunakan standar. Cara perhitunganya hampir sama dengan penghitungan pada hitungan kuantitatif HPLC.
0 komentar:
Posting Komentar